Hintergrund: Die dreidimensionale Bildgebung der Kornea unter physiologischen Bedingungen setzt ein Kontrastverfahren voraus, das möglichst ohne extern eingebrachte Farbstoffe Zellen und extrazelluläre Matrix hochauflösend abbildet. Ausgerechnet die wesentliche Eigenschaft der Transparenz der Kornea macht allerdings ihre extrazelluläre Matrix für farbstofffreie Streulichtverfahren unsichtbar. Die nichtlineare Optik hält für die Visualisierung der extrazellulären Matrix neuartige Kontrastverfahren bereit. Methoden: Die auf Femtosekunden Laser gestützte Mikroskopie beruht auf der nichtlinearen optischen Wechselwirkung der räumlich und zeitlich hoch konzentrierten Laserstrahlung mit dem Gewebe. Die Vorteile der Methode gegenüber herkömmlichen Laserscanning Verfahren liegen bei einer intrinsischen Tiefenselektivität, einer reduzierten Phototoxizität und einer hohen Eindringtiefe des vergleichsweise längerwelligen Lichts. Für die Visualisierung der kornealen Substrukturen sind besonders zwei Kontrastverfahren interessant, die Zweiphotonen angeregte Eigenfluoreszenz des zellulären NADH und NADPH und die Frequenzverdopplung (Second Harmonic Generation, SHG) im Kollagen I des Stromas. Ergebnisse: Am Beispiel von ex-vivo Aufnahmen der Hornhaut des Kaninchens wird die Leistungsfähigkeit der nichtlinearen Mikroskopie deutlich. Im Epithel lässt sich die Schichtung aus Schuppenzellen, Flügelzellen und Basalzellen über die NAD(P)H-Eigenfluoreszenz ohne Farbstoff dreidimensional aufnehmen, im Stroma werden analog die Keratozyten visualisiert. Die lamellare Schichtung der Kollagenfibrillen im Stroma ist in virtuellen Tiefenschnitten im SHG Bild zu sehen. In den transkorneal erfassten SHG Schichtbildern tritt analog zur Architektur der Kollagenlamellen eine charakteristische Streifung auf mit zunehmend großflächiger werdender Ausrichtung und wechselnden Winkeln von 90° und 45° von anterior zu posterior. Diese Streifung fehlt allerdings in der Rückwärtsdetektion. Erste Ergebnisse an photochemisch mit Riboflavin und UVA Strahlung quervernetzter Hornhaut im Tiermodell zeigen eine Signatur noch 5 Wochen nach Behandlung in Form einer inhomogeneren Verteilung Keratozyten-Autofluoreszenz. Schlussfolgerungen: Wie an diesem Beispiel und an aktuellen internationalen Forschungsarbeiten zu erkennen ist, entwickelt sich die Femtosekundenlaser gestützte Mehrphotonenmikroskopie zu einem farbstofffreien Bildgebungsverfahren für die Kornea und ergänzt Verfahren wie die Optische Kohärenztomographie und die konfokale Streulichtmikroskopie.